牛呼吸道疾病（BRD）在兩周到六個月大的犢牛中很常見，是造成牛犢和飼養(yǎng)場牲畜死亡的主要原因（Johnson等，2011； Larsen）等，1999； Virtala等，1999）。 BRD涉及多種病原，包括牛呼吸道合胞病毒（BRSV），牛冠狀病毒（BCoV），3型牛副流感病毒（BPI3），溶血性曼海姆氏菌，多殺巴斯德氏菌，索氏嗜血桿菌和牛支原體（Angen等，2009； Frisis和Krogh，1983；Kusiluka et al。，2000; Larsen et al。，1999; Tegtmeier等，1999）。 牛皰疹病毒1（BoHV-1）和牛病毒性腹瀉病（BVDV）也可以是致病的病原，但是這些病原已在包括丹麥在內(nèi)的多個國家中被*。
在美國，超過90％的牧場會受到BRD的影響，據(jù)報道在中大型澳大利亞牧場中BRD的發(fā)生率為18.2％（Hay等人，2014）。 2014年，丹麥奶牛的估計死亡率為7-10％，而BRD被認(rèn)為是造成10-35％死亡的原因（Grønbæk等，2016）。在近的調(diào)查中，愛爾蘭研究中10％的小牛死亡率歸因于BRD，英國的BRD患病率為45.9％，發(fā)病率為10.1％（Johnson等，2017）。可以通過幾種策略來控制BRD，例如正確使用初乳（Pardon等，2015）或接種疫苗計劃（Richeson等，2008）。抗生素在BRD治療和控制中的廣泛使用（De Briyne等人，2014）是抗生素在經(jīng)濟(jì)動物中的主要用途之一（Fulton，2009； Nickell和White，2010）。 BRD是與宿主易感性，環(huán)境條件，管理以及病原載量等多因素相關(guān)。感染會導(dǎo)致呼吸道發(fā)炎并損害呼吸道，嚴(yán)重的會導(dǎo)致死亡。發(fā)病機(jī)理被認(rèn)為是原發(fā)性病毒感染和隨后上皮細(xì)胞引起的細(xì)菌性繼發(fā)性感染（Angen等，2009; Sudaryatma等，2018）所致。病毒與免疫系統(tǒng)的相互作用會導(dǎo)致免疫抑制，從而削弱宿主對繼發(fā)性細(xì)菌感染的免疫反應(yīng)（Czuprynski等，2004）。 BRD的現(xiàn)場診斷基于臨床癥狀，臨床標(biāo)本的微生物學(xué)診斷適合多種樣本，例如氣管抽吸液，鼻拭子和肺組織樣本。然而，通常會遇到假陰性結(jié)果，因為細(xì)菌可能是互相競爭或生長緩慢，并且可能其他細(xì)菌生長更快（Bell等人，2014; Kugadas等人，2014; Shanthalingam等人，2014; Tegtmeier等人，2000）。盡管經(jīng)常使用諸如ELISA之類的血清學(xué)檢測方法來表明牛先前感染過牛分枝桿菌，但由于血清產(chǎn)生抗體通常需要兩周或更長時間，因此在早期感染中會出現(xiàn)假陰性結(jié)果（Howard等人，1986; Petersen等人，2018）。已經(jīng)開發(fā)出了廣泛的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）分析方法來單獨測試BRD中涉及的每種病原（Amer等人，2013; Bell等人，2014; Klem等人，2019; Kishimoto等人（2017年； Rahpaya等人，2018年）。然而，對于單一靶向PCR來分別檢測多種BRD病原成本非常昂貴。為了克服這個問題，近開發(fā)了一種多重PCR檢測方法（Zhang等，2017）。盡管個別細(xì)菌或病毒可以單獨導(dǎo)致疾病，但混合性感染在BRD中常有放生。實現(xiàn)對這些病原的快速診斷對于實施適當(dāng)?shù)闹委熀涂刂拼胧┮仓陵P(guān)重要。常規(guī)PCR是有問題的，因為在健康和患病的牛犢中都可能存在病原。在多種病原同時存在的情況下，臨床標(biāo)本中病原的定量檢測大大增加了微生物診斷的價值（Lima等，2016； Pedersen等，2014，2013）。
近，發(fā)表了一種用于檢測BRD相關(guān)細(xì)菌病原體的多重定量PCR（qPCR）方法，證明在與兩種或多種病原共感染時，其qPCR檢測性能優(yōu)于培養(yǎng)方法（Loy等人，2018）。DNA Diagnostic A / S公司為了提供一種可以快速檢測多種BRD病原方法，已經(jīng)開發(fā)了Pneumo 4多重病原qPCR檢測方法。Pneumo 4檢測試劑盒分Pneumo 4B（細(xì)菌）和Pneumo 4V（病毒）兩管檢測，可以分別快速地特異性地同時檢測和定量與BRD相關(guān)聯(lián)的四種細(xì)菌（溶血性曼海姆氏菌，多殺巴斯德氏菌，睡眠嗜組織菌Histophilus somni，牛支原體）和五種病毒（BPI3，BCoV，BRSV，BoHV-1和BVDV。對這9種病原的檢測可在同一反應(yīng)條件下分2管PCR反應(yīng)完成，與并行運行的多個單重qPCR分析相比，診斷實驗室在成本和處理時間方面具有優(yōu)勢。
Pneumo4B和Pneumo4V每次檢測分別能夠檢測10個拷貝的基因組DNA和10-50個拷貝的靶RNA，這與以前建立的報告每個反應(yīng)100-250個拷貝的方法具有可比性（Rahpaya等人，2018） 。 Pneumo4B檢測表明，許多氣管抽吸液（TA樣品）對溶血支原體，多殺性巴氏桿菌或沙門氏菌PCR呈陽性，而通過培養(yǎng)方法呈陰性。這些結(jié)果表明存在細(xì)菌，但由于其培養(yǎng)基的傾向性或培養(yǎng)中其他細(xì)菌過度生長而無法被檢測到（Bell等人，2014; Van Driessche等人，2017）。Pneumo4B的PCR方法可能會克服伴隨的菌群的影響，并在傳統(tǒng)培養(yǎng)失敗的混合樣本中檢測到病原（Loy et al，2018）。確定Pneumo4B的診斷特異性和敏感性時，必須考慮將培養(yǎng)物作為參考標(biāo)準(zhǔn)測定法的局限性。如果Pneumo4B正確地鑒定了培養(yǎng)未檢測到的細(xì)菌種類，則Pneumo4B分析的特異性將被低估。如先前報道，少數(shù)樣品通過培養(yǎng)對細(xì)菌呈陽性，而在Pneumo4B分析中呈陰性，證實qPCR可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果，如先前報道（Bell et al，2014）。對此的解釋可能是引物/探針錯配，在儲存或處理過程中核酸降解或在提取過程中出現(xiàn)技術(shù)錯誤。大多數(shù)培養(yǎng)陽性/ PCR陰性樣品含有少量細(xì)菌，這可能是與用于培養(yǎng)的較大體積樣品相比，DNA提取樣品量較少的結(jié)果。但是，某些目標(biāo)細(xì)菌可能在引物或探針識別位點具有序列變異。 PCR抑制劑也可能導(dǎo)致了這些結(jié)果，因為我們發(fā)現(xiàn)一些培養(yǎng)陽性/ PCR陰性的樣品來自內(nèi)部擴(kuò)增對照（IAC）的PCR信號低得令人無法接受（無信號或Ct> 32），DNA提取物的5倍稀釋液并在重新測試后變?yōu)?span style="font-family:helvetica neue">PCR陽性。但是，在我們的方法比較中，我們將此類樣品歸類為PCR陰性。與參考方法相比，通過Pneumo 4B進(jìn)行的牛支原體qPCR測試在氣管抽吸液（TA樣品）中檢測出更多陽性。我們不能排除Pneumo 4B可能與其他支原體物種發(fā)生交叉反應(yīng)的情況，而在當(dāng)前的研究中尚未對此進(jìn)行測試。但是，在兩種方法均為陽性的樣品中，Pneumo4B的結(jié)果比標(biāo)準(zhǔn)PCR的結(jié)果低3–4 Ct值，這表明該檢測方法對牛支原體的靈敏度比參考方法高。影響PCR擴(kuò)增效率的因素有很多，例如樣品的存儲和運輸和DNA提取方法差異（Bowman等，2016; Dilhari等，2017）。
DNA Diagnostic A / S公司采用經(jīng)過國家獸醫(yī)實驗室認(rèn)可的丹麥單重分析qPCR病毒檢測方案作為參考標(biāo)準(zhǔn)。與這些標(biāo)準(zhǔn)方法相比，Pneumo 4V多重檢測的靈敏度相同或稍高。某些樣本在Pneumo4V PCR中對BPI3，BCoV或BRSV呈陽性，而在標(biāo)準(zhǔn)PCR中呈陰性。而只有一例標(biāo)準(zhǔn)PCR呈陽性，而Pneumo4V呈陰性。這些陽性樣品的Ct值為30以上。我們不能排除通過交叉污染或與本研究中未測試的其他病毒物種的非特異性擴(kuò)增可能產(chǎn)生高Ct的可能性。但是，丹麥養(yǎng)殖場的樣本上驗證了Pneumo 4V的診斷敏感性和特異性有一個限制，因為丹麥沒有BoHV-1和BVDV病毒感染了。因此，無法評估BoHV-1和BVDV的診斷敏感性。在Pneumo 4V和標(biāo)準(zhǔn)PCR中，所有TA樣品的結(jié)果均確實對BoHV-1和BVDV陰性，表明在Pneumo 4V中對這兩種病毒的檢測與丹麥的其他牛呼吸道病毒沒有交叉反應(yīng)。對于在沒有BoHV-1 / BVDV的國家/地區(qū)常規(guī)使用，重要的是BoHV-1 / BVDV檢測方法必須具有高特異性，因為假陽性檢測可能會對監(jiān)管和貿(mào)易產(chǎn)生影響。需要進(jìn)行其他研究以評估Pneumo 4V對含有BoHV-1和BVDV的臨床樣品的敏感性。
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